本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pczn1-gc融合蛋白及其应用。

背景技术：

伪狂犬病（pseudorabies，pr）是由伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus，prv）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。世界卫生组织将其列为b类动物传染病，我国也将其列为二类动物传染病。猪是prv的天然宿主，该病对猪危害性大，具有高度隐性感染的特点，可引起持续性感染，特别是耐过的母猪常呈潜伏感染，长期带毒。尽管当前临床上已广泛使用了prv疫苗，但2011年以来，许多规模化猪场爆发了prv流行，主要表现为猪群ge抗体阳性率显著升高，发病母猪群流产、仔猪神经症状和死亡率高等典型伪狂犬病症状。随后，该病在我国多地规模化猪场相继爆发和流行。

prv为线形双股dna病毒，基因组大小约为143kb，包括70多个开放性阅读框，可以编码70～100种病毒蛋白，基因组g+c含量在疱疹病毒中最高达73%。病毒粒子最外层是病毒囊膜，囊膜上镶嵌有病毒编码的囊膜蛋白，大多是糖蛋白，在prv感染细胞时介导着病毒与细胞之间的相互作用，并对病毒在细胞之间的扩散发挥着重要的作用，也是动物机体的免疫系统识别的主要靶抗原。其中有11种糖蛋白，分别命名为gb(gil)、gc(gⅲ)、gd(gp50)、ge(gi)、gg(gx)、gh、gi(gp63)、gk、gl、gm和gn。

gc糖蛋白是介导prv病毒与靶细胞的黏附所必须，其表面的3个肝素结合区域(hbds)是gc糖蛋白n端的抗体结合区域(44～290氨基酸)的一部分，用gc特异性抗体结合该区域可干扰病毒的黏附作用。对国内新分离毒株研究发现，gc糖蛋白氨基酸序列在abd区域均存在8个连续氨基酸的插入，这可能会改变该区的环状结构，从而影响gc抗体与其有效结合，这可能也是造成bartha株疫苗对当前prv流行株免疫效果低下的原因之一。目前，养猪生产临床上使用的猪伪狂犬病血清学检测试剂盒只有针对ge和gb抗体检测，亟需研发生产一种能检测猪血液中prv-gc蛋白抗体的试剂及方法，用以评定猪伪狂犬病疫苗免疫效果及猪抗prv感染的能力。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种pczn1-gc融合蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种pczn1-gc融合蛋白，所述蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示。

一种编码所述蛋白的基因，其序列如seqidno.2所示。

所述的pczn1-gc融合蛋白在制备检测猪血液中prv-gc蛋白抗体试剂中的应用。

本发明的优点在于：

本发明所述pczn1-gc融合蛋白具有于prv-gc蛋白相同的生物学活性，包被于elisa板可检测猪血液中prv-gc蛋白抗体，prv-gc蛋白抗体可阻止prv病毒与靶细胞的黏附，因此，本发明成果能检测猪血液中prv-gc蛋白抗体，进一步评定猪伪狂犬病疫苗免疫效果及猪抗prv感染的能力。并且，pczn1-gc融合蛋白容易表达，大大降低了表达生产成本，可用于商品化生产及推广使用。

附图说明

图1pcr扩增结果，m:marker；line1:pcr扩增产物；line2:空白对照。

图2部分序列比对结果图。

图3基因酶切鉴定图，m:marker；line1:酶切前质粒；line2:酶切后质粒。

图4载体构建图谱。

图5蛋白表达鉴定sds-page分析结果，m:蛋白质分子质量标准；1:未诱导；2:诱导后；3:诱导破碎后上清；4:诱导破碎后沉淀。

图6蛋白纯化sds-page分析结果，m:蛋白质分子质量标准，1:破碎后处理样品，2:流出，3:洗脱。

图7蛋白westernblot鉴定分析结果，m:蛋白质分子质量标准，1:纯化后样品。

图8包被不同抗原浓度的反应结果。

图9血清不同稀释度的反应结果。

具体实施方式

实施例1

一、试剂和耗材

pczn1质粒、top10菌株、arctic-expresstm表达菌：福建省农业科学院畜牧兽医研究所保种；

proteinmarker：thermo公司；

iptg、acr、bis、tris：sigma公司；

sds：amresco公司；

temed：bio-rad公司；

限制性内切酶：takara公司；

pfudna聚合酶：zoonbio公司，货号pc12；

tyrptone、yeastextract：oxoid公司；，

pcrsupermix试剂盒、agarose：北京全式金生物技术有限公司；

dna胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒：axygen公司；

pcr管、枪头等耗材：fisher公司；

0.22μm无菌滤器和透析袋：millipore公司；

ni-ida亲和层析胶：novagen公司；

其它试剂均为国产分析纯或化学纯。

二、主要实验仪器

allegra21r台式高速冷冻离心机(美国beckman公司)

台式高速离心机(德国sorval公司)

biologiclp层析系统、miniproteanii垂直平板电泳系统、geldoc2000成像系统、水平电泳系统(美国bio-rad公司)

ptc-200基因扩增仪(美国mjresearch公司)

320-sph计(美国mettlertoledo公司)

ar5120电子天平(美国ahoms公司)

multitempiii恒温水浴锅、hoferμv-25紫外透射仪(美国amershampharmacia公司)

雪花状制冰机(日本sanyo公司)

jy92-2d超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所)

超净工作台(中国苏净集团)

nanodrop2000（thermo公司）

三、实验方法及结果

1.pczn1-gc重组质粒的构建

1.1引物设计

采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法，设计全长拼接引物，引物序列为：

上游-f:5'-catatgggcacgacgcccaccggg-3'，

下游-r:5'-tctagattagctggtcacgacgggccagc-3'。

1.2pcr扩增反应

pcr反应的体系为：pcrsupermix12.5微升、上下游引物各0.5微升、模板3微升、无菌去离子水补充至25微升。以提取的dna为模板、以引物（上游-f、下游-r）进行pcr反应，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，取5微升pcr产物，用1%琼脂糖凝胶，80v电泳30min，凝胶成像仪拍照观察，在1302bp处出现一条带，与预期结果相一致，如图1所示。

1.3.pczn1-gc测序验证

将获得的重组质粒pczn1-gc转入top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区域gc基因区域：

catatgggtaccaccccgaccggtggtggtggcggtaatagcagcgccggtgaactgagcccgagcccgcctagtaccccggaaccggtgagcggtaccaccggtgcagcagcaagtaccccggccgccgttagcaccccgcgtgttcctccgccgagcgttagccgccgtaaaccgcagcgcaatggcaatcgcacccgcgtgcatggtgacgaagcaaccagccatggtcgtaaacgtattgtgtgtcgtgaacgcctgtttagtgcccgtgttggtgacgcagttagttttggctgcgccgttgtgccgcgtgccggcgagacatttgaagtgcgcttttgccgtcgcggtcgctttcgcagcccggatgccgatccggaatattttgatgaaccgccgcgtccggaactgccgcgtgaacgtctgctgtttagcagcgccaatgcaagcctggcacatgcagatgcactggccagtgcagttgttgtggaaggtggtcgtgccaccgtggcaaatgttagcggcgaagttagtgtgcgcgttgccgccgccgatgcagaaaccgaaggcgtttatacctggcgtgttctgagcgcaaatggcaccgaagtgcgcagcgcaaatgttagtctggttctgtatcatcagccggaatttggtctgagcgccccgccggtgctgtttggtgaaccgtttcgcgccgtttgtgttgttcgtgattattatccgcgccgtagcgttcgtctgcgttggtttgccgatgaacatccggtggatgcagcatttgtgaccaatagcaccgttgccgatgaactgggccgtcgtacccgtgtgagtgtggttaatgttacccgcgccgatgtgccgggcctggctgcagcagatgatgcagatgcattagcaccgagcctgcgctgtgaagcagtgtggtatcgcgatagtgtggcaagtcagcgttttagtgaagccctgcgcccgcatgtttatcatccggcagccgttagtgttcgttttgttgaaggctttgccgtttgcgatggtctgtgcgtgccgccggaagcacgtctggcatggagtgatcatgcagccgataccgtgtatcatctgggcgcatgcgcagaacatccgggcctgctgaatgttcgcagtgcacgtccgctgagcgatctggatggcccggtggattatacctgccgtctggaaggtatgccgagtcagctgccgatttttgaagatacccagcgttatgatgcaagtccgaccagtgtgagttggccggttgttaccagctaatctaga。

测序结果（gc-f）与预期序列（target）进行比对，截取部分比对序列如图2所示。测序结果与预期序列的相似度高达99.7%。

2.质粒酶切鉴定

2.1酶切体系

质粒3μl

内切酶10.25μl

内切酶20.25μl

10×buffer1.0μl

ddwupto10μl

2.2酶切鉴定结果

酶切结果显示，在1302bp和4400bp出现了与预期相符合的条带。结果如图3所示。

2.3载体构建图谱

pczn1质粒载体大小为4400bp，具有抗amp特性，将目的基因连接于pczn1质粒上，形成表达质粒。如图4所示。

3.原核蛋白表达

3.1原核蛋白的表达鉴定

蛋白大小理论分子量为47.5kd左右（含his-tag），氨基酸序列翻译如下：

mnhkvhhhhhhmgttptgggggnssagelspsppstpepvsgttgaaastpaavstprvpppsvsrrkpqrngnrtrvhgdeatshgrkrivcrerlfsarvgdavsfgcavvpragetfevrfcrrgrfrspdadpeyfdepprpelprerllfssanaslahadalasavvveggratvanvsgevsvrvaaadaetegvytwrvlsangtevrsanvslvlyhqpefglsappvlfgepfravcvvrdyyprrsvrlrwfadehpvdaafvtnstvadelgrrtrvsvvnvtradvpglaaaddadalapslrceavwyrdsvasqrfsealrphvyhpaavsvrfvegfavcdglcvppearlawsdhaadtvyhlgacaehpgllnvrsarplsdldgpvdytcrlegmpsqlpifedtqrydasptsvswpvvts。

3.1.1pczn1-gc载体转化至大肠杆菌arcticexpress

（1）将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；

（2）42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μllb培养液；

（3）37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mlamp的lb平板，37℃倒置培养过夜。

3.1.2iptg诱导pczn1-gc载体融合蛋白的表达

（1）挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mlamp的3mllb培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；

（2）次日按1:100接种于50μg/mlamp的30mllb培养液中，37℃220r/min振摇至菌体od600为0.6-0.8（约2h）；

（3）取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

（4）向剩余的培养物中加入iptg至终浓度为0.5mm，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；

（5）取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用pbs重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

（6）进行12%sds-page检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图5所示。

3.1.3表达鉴定结果分析

利用iptg诱导蛋白表达，经12%sds-page分析显示表达的目的条带与预期的相一致，目标蛋白主要存在于沉淀中，目标蛋白命名为“pczn1-gc融合蛋白”，结果如图5所示。

3.2包涵体蛋白的变复性

（1）将菌体沉淀重悬于20ml裂解液（20mmtris-hclcontaining1mmpmsfandbacteriaproteaseinhibitorcocktail，ph8.0），超声破碎（功率400w，工作4sec，间歇8sec，共20min）；

（2）将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

（3）使用包涵体洗涤液（20mmtris，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100，ph8.0）洗涤包涵体3次；

（4）用溶解缓冲液（20mmtris，5mmdtt，8m尿素，ph8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；

（5）将上述溶液滴加20mmtris-hcl，0.15mnacl，ph8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mmtris-hcl，0.15mnacl，ph8.0溶液中透析过夜。

3.3融合蛋白的ni柱亲和纯化及结果分析

3.3.1ni柱纯化

（1）利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱；

（2）用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；

（3）用ni-idawashing-buffer（20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0）以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；

（4）用ni-idaelution-buffer（20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0）以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

（5）上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mmtris-hcl，0.15mnacl，ph8.0进行透析过夜；

（6）进行12%sds-page分析,结果如图6所示。

3.3.2纯化结果分析

包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12%sds-page分析。纯化后的目标蛋白，经12%sds-page分析，于47.5kd处出现单独一条条带，与预期结果相一致。结果如图6所示。

3.3westernblot方法及结果分析

3.3.1westernblot步骤

（1）取样品上样5μl

（2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升至200v直到电泳结束。

（3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，约为1.5h，恒流250ma。

（4）电转结束后，取下膜后先用pbst洗涤4次，每次5min。

（5）将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。

（6）用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。

（7）次日将膜取出后用pbst洗膜4次，每次5min，

（8）用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。

（9）反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。

（10）ecl显影，曝光。

3.3.2westernblot结果分析

一抗以及二抗稀释比例：

westernblot结果显示，于47.5kd处出现免疫反应条带，与预期结果相一致。结果如图7所示。

4、elisa方法的建立

用纯化后的目标蛋白“pczn1-gc融合蛋白”为包被抗原制备elisa板，检测猪血清中prv-gc抗体水平，优化获得最佳实验检测条件。

4.1抗原包被最佳浓度和血清最佳稀释度

采用矩阵滴定法，横排选择抗原浓度（15ug/ml、10ug/ml、7ug/ml、4ug/ml）,纵排选择血清抗体稀释度（1:20、1:50、1:100、1:150）,每个滴度重复一次，当抗原包被浓度为10ug/ml，p/n值为2.103（如图8），血清为1:50稀释时，p/n值为2.11（如图9），因此，最佳抗原包被浓度为10ug/ml，最佳血清抗体稀释度为1:50。

4.2抗原包被时间

包被时间：37℃作用30min；37℃作用60min；37℃作用90min；37℃作用120min；4℃作用过夜。其中，37℃作用60min的效果最好。

4.3血清反应时间

加入血清后反应的时间15min、30min、45min、60min、90min，其中30min反应的效果最好。

4.4酶标二抗反应时间

加入酶标二抗后反应的时间15min、30min、45min、60min、90min，其中30min反应的效果最好。

4.5底物显色反应时间

加入底物（tmb）显色反应的时间5min、10min、15min、20min、30min，其中10min反应的效果最好。

4.6elisa临界值

在最佳工作浓度和最适反应时间条件下，对收集的30份prv抗体（ge抗体和gb抗体）阴性的猪血清进行间接elisa方法检测，确定阴阳性临界值（x+3sd）值为0.249，（x+2sd）值为0.207。

4.7间接elisa方法的特异性和重复性试验

利用表达的pczn1-gc融合蛋白作为诊断抗原包被elisa板检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）阳性血清、猪流行性腹泻病毒（pedv）阳性血清、猪圆环病毒2型（pcv-2）阳性血清、猪瘟病毒（pedv）阳性血清、猪细小病毒（ppv）阳性血清，所测得od650值分别为0.067、0.073、0.065、0.069、0.058，均小于0.207，表明所建立的方法与上述病毒血清无交叉反应，特异性好。对prv抗体效价高、中、低的三份血清进行测定，其中高效价的s/n值为0.064、中效价的s/n值为0.243、低效价的s/n值为0.536，计算板内、板间的变异系数，种血清板内检测的变异系数分别为2.4%、3.1%、1.8%，以及板间的变异系数分别为2.3%、2.8%、2.0%。结果均小于5%，表明建立的间接elisa方法有较好的重复性。

4.8临床样品检测

利用4.1-4.7步骤所优化好的条件包被的elisa板，并对13份未免疫prv疫苗的猪血清，50份已免疫勃林格公司prv疫苗30天的猪血清，结果显示，13份未免疫的猪血清od650值均小于0.207，为阴性；来自某规模化猪场的50份有免疫勃林格公司prv疫苗的猪血清od650值均大于0.733，为阳性；完全符合实验预期，表明本申请利用所述pczn1-gc融合蛋白建立的间接elisa方法可用于prv抗体的临床检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

福建省农业科学院畜牧兽医研究所

一种pczn1-gc融合蛋白及其应用

4

4

patentinversion3.3

1

441

prt

人工序列

1

metasnhislysvalhishishishishishismetglythrthrpro

151015

thrglyglyglyglyglyasnserseralaglygluleuserproser

202530

proproserthrprogluprovalserglythrthrglyalaalaala

354045

serthrproalaalavalserthrproargvalproproproserval

505560

serargarglysproglnargasnglyasnargthrargvalhisgly

65707580

aspglualathrserhisglyarglysargilevalcysarggluarg

859095

leupheseralaargvalglyaspalavalserpheglycysalaval

100105110

valproargalaglygluthrphegluvalargphecysargarggly

115120125

argpheargserproaspalaaspproglutyrpheaspglupropro

130135140

argprogluleuproarggluargleuleupheserseralaasnala

145150155160

serleualahisalaaspalaleualaseralavalvalvalglugly

165170175

glyargalathrvalalaasnvalserglygluvalservalargval

180185190

alaalaalaaspalagluthrgluglyvaltyrthrtrpargvalleu

195200205

seralaasnglythrgluvalargseralaasnvalserleuvalleu

210215220

tyrhisglnproglupheglyleuseralaproprovalleuphegly

225230235240

glupropheargalavalcysvalvalargasptyrtyrproargarg

245250255

servalargleuargtrpphealaaspgluhisprovalaspalaala

260265270

phevalthrasnserthrvalalaaspgluleuglyargargthrarg

275280285

valservalvalasnvalthrargalaaspvalproglyleualaala

290295300

alaaspaspalaaspalaleualaproserleuargcysglualaval

305310315320

trptyrargaspservalalaserglnargpheserglualaleuarg

325330335

prohisvaltyrhisproalaalavalservalargphevalglugly

340345350

phealavalcysaspglyleucysvalproproglualaargleuala

355360365

trpserasphisalaalaaspthrvaltyrhisleuglyalacysala

370375380

gluhisproglyleuleuasnvalargseralaargproleuserasp

385390395400

leuaspglyprovalasptyrthrcysargleugluglymetproser

405410415

glnleuproilephegluaspthrglnargtyraspalaserprothr

420425430

servalsertrpprovalvalthrser

435440

2

1302

dna

人工序列

2

catatgggtaccaccccgaccggtggtggtggcggtaatagcagcgccggtgaactgagc60

ccgagcccgcctagtaccccggaaccggtgagcggtaccaccggtgcagcagcaagtacc120

ccggccgccgttagcaccccgcgtgttcctccgccgagcgttagccgccgtaaaccgcag180

cgcaatggcaatcgcacccgcgtgcatggtgacgaagcaaccagccatggtcgtaaacgt240

attgtgtgtcgtgaacgcctgtttagtgcccgtgttggtgacgcagttagttttggctgc300

gccgttgtgccgcgtgccggcgagacatttgaagtgcgcttttgccgtcgcggtcgcttt360

cgcagcccggatgccgatccggaatattttgatgaaccgccgcgtccggaactgccgcgt420

gaacgtctgctgtttagcagcgccaatgcaagcctggcacatgcagatgcactggccagt480

gcagttgttgtggaaggtggtcgtgccaccgtggcaaatgttagcggcgaagttagtgtg540

cgcgttgccgccgccgatgcagaaaccgaaggcgtttatacctggcgtgttctgagcgca600

aatggcaccgaagtgcgcagcgcaaatgttagtctggttctgtatcatcagccggaattt660

ggtctgagcgccccgccggtgctgtttggtgaaccgtttcgcgccgtttgtgttgttcgt720

gattattatccgcgccgtagcgttcgtctgcgttggtttgccgatgaacatccggtggat780

gcagcatttgtgaccaatagcaccgttgccgatgaactgggccgtcgtacccgtgtgagt840

gtggttaatgttacccgcgccgatgtgccgggcctggctgcagcagatgatgcagatgca900

ttagcaccgagcctgcgctgtgaagcagtgtggtatcgcgatagtgtggcaagtcagcgt960

tttagtgaagccctgcgcccgcatgtttatcatccggcagccgttagtgttcgttttgtt1020

gaaggctttgccgtttgcgatggtctgtgcgtgccgccggaagcacgtctggcatggagt1080

gatcatgcagccgataccgtgtatcatctgggcgcatgcgcagaacatccgggcctgctg1140

aatgttcgcagtgcacgtccgctgagcgatctggatggcccggtggattatacctgccgt1200

ctggaaggtatgccgagtcagctgccgatttttgaagatacccagcgttatgatgcaagt1260

ccgaccagtgtgagttggccggttgttaccagctaatctaga1302

3

24

dna

人工序列

3

catatgggcacgacgcccaccggg24

4

29

dna

人工序列

4

tctagattagctggtcacgacgggccagc29